當前，細菌耐藥性問題日趨嚴重，給臨床治療帶來困難，對卜內酞胺類抗生素而言，某些菌青霉素結合蛋白(PBps)改變造成的耐藥性，是卜內酞胺類抗生素的特點。一般細菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質，是細菌致死的靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與卜內酞胺類抗生素不易結合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法 研究 PBPs圖譜，以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以，PBPs測定技術是 研究 壓內酸胺類耐藥性的重要手段。用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜，需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國內有關PBps測定技術報道甚少，以3H標記者更少，本文介紹這一技術。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1菌種肺炎鏈球菌31003，30301（北京藥品生物制品檢定所）；Pen08.R6本室保存菌種。
1.1.2培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基。
1.1.3僅器及藥品
垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠)；NG一l型真空凝膠干燥器(太倉電視機廠)；TGLL一1a型臺式高速冷凍離心機(中科院上海生物化學 研究 所)；8438一超低溫冰箱(FormaSclentifi。，美國)；電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用 分析 儀器廠)；丙烯酞胺(Aerylamide，臨海止學廠產(chǎn))；甲撐雙丙烯酞胺.(big；瑞士產(chǎn)品)；N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前進農(nóng)場制劑廠)；3H標記青霉素乙酞呱陡鹽(NewEngiandNuclear，美國)；x光底片(天津感光材料廠；KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em)；2，5一二苯基嗯哇(PPO，閃爍純，上海試劑一廠)；月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl，Sigma)；十二烷基硫酸鈉(SDs，上海新華化工廠)；二甲基亞礬(DMso，北京旭東化工廠)。
1.2 方法
1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，次日再移種新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2~3h至對數(shù)生長期，菌數(shù)約為個/ml(CFU/ml)，菌液分裝試管，每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標記青霉素37℃保溫10min，在冰浴中加入5非標記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml，冷凍離心5000：/minlom仇，棄去上清，菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保溫10min使細胞溶解，加入30協(xié)一樣品緩沖液，煮沸3min，置室溫備用。
1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm)，凝膠配方：分離膠(10%)：Aerylamide：bis(30：0.5)6.7ml，Tris(pH8.8，1.5ml/ l)5ml，10%SDS 0.2ml，蒸餾水8.1ml，真空攪拌10一15min除去氣體，再加入TEMED，濃縮膠(5%)：按上述配方依次為1.7ml，2.5ml，0.1而，5.6ml，7.5，和150。先配制分離膠，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時維持電壓在60v，至染料前沿到達分離膠和濃縮膠交界處調高電壓至120v，走完全程約需3一4h，用考馬斯藍R250染色30一45min，過夜脫色。
1.2.3關光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min，再用新鮮DMSo再次處理30而n，20%即。處理2一3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進行真空干燥，將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內，放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Zwr，將x光底片顯影，定影，沖洗得到PBPs的放射自顯影圖譜。x光底片預曝光條件：國產(chǎn)x光底片用照相閃光燈紅色濾光片，加6層紅色玻璃紙濾過，x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙，距離50cm，閃光燈閃二次；進口x光底片預曝光用x光機最小功率100mA40kV，距離40em，每張x光底片曝光0.04s。
1.2.4竟爭性結合試驗定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min，然后加入飽和量的氛標記青霉素，37℃保溫10min，再按上述方法繼續(xù)進行實驗。
2 結果與討論
本法測定肺炎鏈球菌全細胞中pBps的含量，首先需要分離菌體蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來，與此同時，已經(jīng)與青霉素結合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來。樣品制備完畢，煮沸3min，以便除去某些蛋白質的干擾，青霉素與PBPs結合較牢固，不會被破壞。
本實驗采用SDS一PAGE方法，SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。
氖標記物穿透力較弱，用一般放射自顯影方法不能得出圖象，本實驗采用熒光放射自顯影法(Fluoro，aphy)，檢測聚丙烯酞胺凝膠片上3H標記的蛋白質，有一定的優(yōu)點。PPO是熒光增效劑，其作用原理不是直接依賴sH放射出來的日射線，而是藉助3H上的日粒子與PPO相互作用發(fā)射出的光，造成x光底片的局部發(fā)黑得到深淺不同的暗線，從而獲得青霉素結合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區(qū)帶，即p即；(a，b)，pBpZ和pBp3。一般情況下，青霉素濃度越大，親和力越強，顏色越深，在競爭性試驗中，甲氧西林濃度越大，親和力越強，顏色越淺。
據(jù)報道，x光底片預曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度，因為預曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖象吸收值之間的非線性關系，所以，經(jīng)預曝光的x光底片上所得到的圖象可以正確反映出樣品的放射性分布情況。
用國產(chǎn)x光底片不經(jīng)預曝光時，無圖象出現(xiàn)，經(jīng)預曝光則有圖象出現(xiàn)，用進口x光底片未經(jīng)預曝光者，圖象的暗線區(qū)別不大。預曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖象。國產(chǎn)x光底片與進口x光底片比較，國產(chǎn)片敏感性較低，預曝后的x光底片上出現(xiàn)的暗線普遍較淺且細。
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